Katedra Genetyki Medycznej

Analiza ekspresji wybranych miRNA w surowicy krwi i limfocytach chorych z przewlekłą białaczką limfocytową B-komórkową.

Osoba odpowiedzialna:

dr hab. n. med. Agata Filip

Cele prowadzonych badań:

  1. Porównanie ekspresji wybranych miRNA w limfocytach krwi obwodowej i w surowicy chorych z PBLB

  2. Korelacja ekspresji miRNA z typowymi dla tego rozrostu aberracjami chromosomowymi, obejmującymi chromosomy 11, 12, 13 i 17

  3. Korelacja ekspresji miRNA z innymi znanymi czynnikami prognostycznymi w PBLB: ekspresją CD38 i ZAP70 oraz statusem mutacyjnym genów dla IgVH.

  4. Identyfikacja miRNA krążacych o znaczeniu diagnostycznym i prognostycznym w PBLB

Metody cytogenetyczne i molekularne wykorzystywane w badaniach:

  • metody cytogenetyki klasycznej, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), cytometria przepływowa, qPCR (amplifikacja w czasie rzeczywistym), sekwencjonowanie automatyczne

Podłoże kliniczne badań

Przewlekła białaczka limfocytowa B-komórkowa jest najczęściej występującą postacią białaczki w Europie i Ameryce Północnej. Rozpoznawana zazwyczaj w piątej - szóstej dekadzie życia, ta nieuleczalna choroba ostatnio coraz częściej dotyka osób w młodszym wieku. Roczna zachorowalność wynosi 2 – 6 przypadków na 100 000 osób; zwiększa się z wiekiem, osiągając 12,8/100 000 wśród osób po 65 roku życia. Klinicznie PBL-B jest chorobą heterogenną. Niektórzy pacjenci przeżywają wiele lat nie wymagając leczenia, u innych natomiast obserwuje się szybką progresję mimo agresywnej terapii. Obecnie dostępne czynniki prognostyczne ułatwiają ocenę stopnia zaawansowania choroby u indywidualnego pacjenta i stanowią podstawę decyzji terapeutycznych, jednak nie są do końca skuteczne w prognozowaniu przebiegu PBL-B zwłaszcza, kiedy chorobę rozpoznaje się we wczesnym stadium. Cały czas poszukuje się więc nowych czynników prognostycznych.

MikroRNA to grupa małych, niekodujących RNA, które regulują ekspresję genów na poziomie potranskrypcyjnym. Dojrzała cząsteczka miRNA jest jednoniciowa, ma długość 21 – 23 nt i wiąże się z obszarem 3’ UTR mRNA genu docelowego, powodując zahamowanie translacji lub degradację transkryptu. Ludzkie miRNA stanowią około 2% genomu, mogą brać udział w regulacji ekspresji nawet 30% genów strukturalnych. Wpływając na różnicowanie komórek macierzystych, utrzymywanie określonego profilu ekspresji genów poszczególnych tkanek, kontrolę proliferacji i programowanej śmierci komórki oraz proces przekazywania sygnału miRNA mają szczególne znaczenie dla onkogenezy. Wiadomo, że profil ekspresji miRNA w nowotworach jest zaburzony. Opisano dotychczas kilka miRNA, których ekspresja może mieć znaczenie dla etiopatogenezy i przebiegu PBL-B: miR-15a, miR-16, miR-29c, miR-155, miR-221.

Przedmiotem badań jest surowica krwi obwodowej i limfocyty 30 chorych z PBLB, hospitalizowanych w Klinice Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku UM w Lublinie. Ekspresja oceniana jest metodą RT-PCR w czasie rzeczywistym. Z limfocytów zakładane są krótkoterminowe hodowle i przygotowywane preparaty cytogenetyczne. Zmiany chromosomowe oceniane są metodami cytogenetyki klasycznej (prążki GTG, prążki RTG) i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Ekspresja CD38 i ZAP70 oceniana jest metodą cytometrii przepływowej, status mutacyjny genów dla IgVH metodą sekwencjonowania.

Jest to próba analizy nieinwazyjnych biomarkerów, jakimi jest ekspresja miRNA w surowicy krwi chorych z PBL-B, i ocena ich przydatności prognostycznej w przewlekłej białaczce limfocytowej B-komórkowej.

Częstość występowania konstytucyjnych mutacji genów BRCA1, BRCA2, CHEK2, NOD2, CDKN2A u chorych na raka piersi oraz osób zdrowych pochodzących z rodzin obciążonych rakiem piersi i/lub jajnika oraz innymi nowotworami.

Osoba odpowiedzialna:

mgr biotechnologii Małgorzata Michalak

Cele prowadzonych badań:

  1. Badanie częstości występowania wybranych mutacji punktowych w grupie pacjentów chorych na raka piersi oraz w grupie zdrowych osób pochodzących z rodzin obciążonych rakiem piersi zamieszkałych na terenie Lubelszczyzny.

  2. Badanie sekwencji genu BRCA2 u pacjentów, u których nie wykryto specyficznych mutacji punktowych predysponujących do rozwoju raka piersi.

  3. Określenie wpływu poszczególnych mutacji na ryzyko zachorowania na raka piersi
    i raka jajnika.

  4. Określenie predyspozycji mutacji do danego typu nowotworu.

  5. Korelacja obecności mutacji z wiekiem wystąpienia choroby.

Metody biologii molekularnej wykorzystywane w badaniach:

  • allelo specyficzna amplifikacja (ASA-PCR), polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (PCR-RFLP), sekwencjonowanie automatyczne.

Podłoże kliniczne badań

Dane epidemiologiczne, dotyczące nowotworów piersi i jajnika są niepokojące. Szacuje się, że w przyszłości jedna na dziesięć kobiet zachoruje na raka piersi, a trzy na dwieście na raka jajnika. 5-10% wszystkich przypadków raka piersi i 10-15% przypadków raka jajnika jest spowodowanych dziedzicznymi mutacjami w obrębie tylko dwóch genów BRCA1 i BRCA2. Mutacje tych genów zwiększają ryzyko zachorowania na raka piersi do 80% oraz ryzyko zachorowania na raka jajnika do 40%. Udowodniono, że obecność tych mutacji jest bardzo istotna dla doboru leczenia. Pacjenci BRCA1/BRCA2 dodatni charakteryzują się zupełnie inną odpowiedzią na chemioterapeutyki niż pacjenci bez mutacji konstytutywnych BRCA1/2. Chorzy BRCA1/2 pozytywni bardzo dobrze odpowiadają na leczenie np. cisplatyną, inhibitorami PARP (polimeraza poli-ADP rybozy). Leczenie chorych BRCA1/BRCA2 dodatnich jest obecnie przedmiotem wielu badań klinicznych. Jednak, aby właściwie dobrać terapię należy najpierw zdiagnozować obecność mutacji.

Oba geny są bardzo długie - 80 tysięcy par zasad, ich rozmiar znacznie utrudnia analizę całej sekwencji. Większość populacji jest bardzo heterogenna pod względem mutacji w obu genach, co oznacza, że należałoby analizować gen w całości, a jest to procesem drogim oraz czasochłonnym. Populacja polska charakteryzuje się pięcioma tzw. mutacjami założycielskimi w obrębie genu BRCA1, co znacznie ułatwia ich wykrycie, ponieważ są one charakterystyczne i występują z największą częstością. Mutacje BRCA2 natomiast są bardzo heterogenne. Częstość występowania poszczególnych mutacji założycielskich BRCA1 oraz ich udział procentowy pośród wszystkich mutacji BRCA1 różni się w poszczególnych rejonach Polski np. w niektórych okręgach obserwuje się znacznie większy odsetek mutacji BRCA1 predysponujących do raka jajnika, a w innych do raka piersi. Ma to wpływ na dobór odpowiedniego testu.

Ponadto wiedza o samej obecności mutacji, w przypadku braku objawów chorobowych, ma bardzo duży wpływ na profilaktykę. Pacjentkom BRCA1/2 pozytywnym od 20 roku życia zaleca sie częste wykonywanie badań w kierunku wczesnego wykrycia raka piersi i jajnika (mammografia, badania USG oraz palpacyjne), przeciwskazana jest antykoncepcja hormonalna, czasami zalecane jest doustne przyjmowanie tamoxifenu, jako czynnika zmniejszającego ryzyko zachorowania. W Stanach Zjednoczonych pacjentki BRCA1/2 pozytywne często decydują się na profilaktyczną obustronną mastektomię oraz obustronną salpingo-ooforektomię. W przypadku obu zabiegów wykazano znaczny spadek ryzyka zachorowania na raka piersi i jajnika (do 85%). Do grupy genów, których mutacje zwiększają ryzyko wystapienia raka piersi należą także m.in. CHEK2, NOD2, CYP1B1, NBS1, CDKN2A, jednak ich wpływ nie jest jednoznacznie zbadany.
Sama profilaktyka jest znacznie tańsza niż leczenie choroby, dlatego badania w kierunku mutacji konstytutywnych są tak istotne – nie tylko dla pacjenta i jego rodziny, ale również dla budżetu.

Analiza zmian klonalnych w przebiegu ostrej białaczki mieloblastycznej z wykorzystaniem techniki klasycznej CGH i macierzy CGH – celem wyodrębnienia użytecznych diagnostycznie markerów proliferacji komórek białaczkowych.

Osoby odpowiedzialne:

dr n. med. Dorota Koczkodaj, mgr biol. Szymon Zmorzyński

Cele prowadzonych badań:

Kompleksowa analiza zmian chromosomowych klonu białaczkowego chorych z ostrą białaczką szpikową:

  1. Badanie aberracji chromosomowych metodami klasycznej cytogenetyki, CGH i mikromacierzy CGH

  2. Porównanie czułości metod CGH i mikromacierzy CGH oraz ich zastosowanie w rutynowych badaniach diagnostycznych.

  3. Potwierdzenie obecności wykrytych aberracji chromosomowych metodą FISH.

  4. Analiza mutacji genów NPM1 i WT1 oraz nadekspresji ERG i BAALC u chorych z prawidłowym kariotypem.

Metody cytogenetyczne i molekularne wykorzystywane w badaniach:

  • metody klasycznej cytogenetyki (prążki G i R)

  • FISH (fluorescence in situ hybridization)

  • metoda HR-CGH, mikromacierze CGH

  • sekwencjonowanie automatyczne (geny: NPM1, WT1)

  • Real time PCR (geny ERG, BAALC)

  • PCR i elektroforeza w żelu agarozowym - detekcja wewnątrztandemowej duplikacji genu FLT3 (FLT3 internal tandem duplication, FLT3-ITD).

Podłoże kliniczne badań:

Ostra białaczka szpikowa (mieloblastyczna, nielimfoidalna) (OBS, ang. acute myleoid leukemia, AML) jest biologicznie heterogenną chorobą nowotworową, klasyfikowaną pod względem klinicznym, immunofenotypowym, cytogenetycznym i molekularnym. W OBS dochodzi do klonalnej proliferacji i kumulacji niedojrzałych morfologicznie oraz czynnościowo komórek blastycznych w szpiku kostnym, krwi obwodowej i tkankach pozaszpikowych. Komórki blastyczne rozwijają się z linii nielimfoidalnej. Prekursorem dla blastów jest transformowana nowotworowo komórka hematopoetyczna szpiku. OBS stanowi 25% wszystkich białaczek, u dorosłych 75-80% ostrych białaczek, a u dzieci około 15% wszystkich przypadków. W Europie OBS występuje z częstością 5-8/100 000/rok, a częstość zgonów na ten nowotwór jest oceniana na 4-6/100 000/rok. Ponad 50% zgonów z powodu białaczki stanowią chorzy na OBS. Roczna liczba zachorowań na ostrą białaczkę szpikową zwiększa się wraz z wiekiem, a u osób powyżej 60 roku życia wynosi do 10/100 000/rok. OBS częściej występuje u mężczyzn niż u kobiet (3:2).

Mutacje mogą obejmować duże obszary genomu – aberracje chromosomowe lub pojedyncze geny – mutacje punktowe.

Klonalne aberracje chromosomowe są identyfikowane u około 55% dorosłych chorych na OBS i są uznane za niezależne czynniki prognostyczne.

Badania cytogenetyczne odgrywają istotną rolę w określeniu podtypu białaczki. Niektóre aberracje strukturalne są charakterystyczne dla podtypu cytomorfologicznego białaczki wg FAB, np. t(8;21) dla podtypu M2; t(15;17), t(11;17), t(5;17) dla podtypu M3; inv/del(l6) dla wariantu eozynofilowego M4 (M4eo). Inne aberracje nie mają związku z określonym podtypem morfologicznym, ale występują w OBS (często wtórnej), a także w zespołach mielodysplastycznych, np. +8, -7/del(7q) lub del(5q).

W zależności od rodzaju występującej aberracji chromosomowej chorych na OBS można stratyfikować do różnych grup ryzyka cytogenetycznego. Do grupy niskiego ryzyka cytogenetycznego zaliczani są chorzy z translokacjami: t(8;21)(q22;q22) lub inv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22) oraz chorzy z t(15;17)(q22;q21). Do grupy pośredniego ryzyka cytogenetycznego zaliczani są chorzy, u których w momencie rozpoznania OBS stwierdza się prawidłowy kariotyp lub rzadkie aberracje chromosomowe, np. + 8, -Y, +6, del(12p), t(9;11)(p22;q23). Chorzy ze złożonymi zmianami w kariotypie: inv(3)(q21q26)/t(3;3)(q21;q26), rearanżacjami regionu 11q23, translokacją t(6;9)(p23;q34), delecjami całych chromosomów lub ich fragmentów - odpowiednio 5 i 7 lub del(5q) i del(7q) mają niekorzystne rokowanie i są zaliczani do grupy wysokiego ryzyka cytogenetycznego. Podobnie niekorzystne rokowanie dotyczy chorych ze złożonym lub monosomalnym kariotypem. Złożony kariotyp charakteryzuje się obecnością trzech lub więcej aberracji. W kariotypie monosomalnym stwierdza się dwie monosomie autosomów lub pojedynczą monosomię z obecnością jednej lub kilku aberracji strukturalnych.

Mutacje genów mają wpływ na rokowanie chorych na OBS. Duplikacja genu FLT3 (FLT3-ITD), mutacja WT1, nadekspresja genów BAALC, ERG oraz MN1 są niekorzystnymi czynnikami predykcyjnymi. Z kolei mutacje genów CEBPA i NPM1 są uznawane za czynniki korzystne. Mutacje w genach będące czynnikami korzystnymi oraz te, które zostały uznane za czynniki niekorzystne mogą pojawić się w tym samym czasie. Mutacje genu KIT, który koduje receptor dla czynnika wzrostu mastocytów (ang. mastocyte growth factor, MGF) o aktywności kinazy tyrozynowej, są niekorzystnie rokującym czynnikiem u chorych z białaczkami CBF..

Aberracje chromosomowe i mutacje punktowe w momencie rozpoznania OBS są istotnymi oraz niezależnymi czynnikami prognostycznymi. Ich analiza ma nie tylko wartość diagnostyczną, rokowniczą i predykcyjną, ale także jest wykorzystywana do rozwoju badań w zakresie terapii celowanej.

Last modified: Thursday, 5 December 2013, 09:08 am
Rozwój Polski Wschodniej
Przebudowa Centrum Innowacyjnych Technologii Nanobiomedycznych Uniwersytetu Medycznego w Lublinie
Projekt finansowany ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego
w ramach Programu Operacyjnego Rozwój Polski Wschodniej