Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej

Program badawczy KBBM koncentruje się wokół patogenezy nowotworów i chorób neurologicznych, ze szczególnym uwzględnieniem wewnątrzkomórkowego mechanizmu działania substancji, które mogą być traktowane jako nowa generacja potencjalnych środków terapeutycznych.

Dotychczasowe badania naukowe, oparte na współpracy z zagranicznymi ośrodkami naukowymi (w przeszłości -Dept. of Pediatric Neurology, Charite, Humboldt University, Berlin oraz obecnie  - Dept. of Pediatric Neurology, Technical University of Dresden, Germany, Department of Neurology, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin, USA), wykazały, że antagoniści receptorów glutaminianowych mogą być traktowani jako nowej generacji chemioterapeutyki, zarówno w warunkach In vitro, jak i In vivo [1,2]. Co więcej, jako pierwsi wykazaliśmy, że antagoniści receptorów NMDA i AMPA hamują szlak metaboliczny kinaz ERK1/2 w komórkach nowotworowych [1,2].

Wyjaśniając funkcję receptorów glutaminianowych w komórkach nowotworowych wykazaliśmy ich obecność w szeregu nowotworowych liniach komórkowych [3] oraz guzach OUN u dzieci [4]. Udowodniliśmy, że receptory glutaminianowe są aktywne (funkcjonalne) w komórkach nowotworowych [3], a ich genetyczne wyciszenie ekspresji powoduje hamowanie proliferacji komórek nowotworowych [4], świadcząc tym samym o istotnej roli tych receptorów w homeostazie nowotworów.
Obecnie badania KBBM koncentrują się również na substancjach chemicznych – potencjalnych lekach działających na poziomie receptorów związanych z białkami G. Badania te prowadzone są w ścisłej współpracy z krajowymi zespołami naukowymi  (Leczniczych, Samodzielna Pracownia Chemii i Neuroinżynierii Medycznej UM w Lublinie) oraz ośrodkami zagranicznymi (Institute of BioMedicine, University of Turku, Finland). Badania wykonywane w KBBM mają na celu analizę aktywacji/deaktywacji  szeregu wewnątrzkomórkowych szlaków sygnalizacyjnych pod pływem substancji działających na poziomie receptorów oraz wynikającej  z tego działania zmiany ekspresji poszczególnych genów.  Wyjaśniając molekularny mechanizm działania różnego typu substancji chemicznych – potencjalnych leków syntetyzowanych (Leczniczych UM w Lublinie) i charakteryzowanych pod względem interakcji z receptorami (Samodzielna Pracownia Chemii i Neuroinżynierii Medycznej UM w Lublinie) przez naszych Partnerów, wykorzystujemy wiele zaawansowanych technik badawczych z zakresu biochemii i biologii molekularnej, jak również doświadczenie badawcze członków naszego zespołu. Ponieważ większość naszych badań prowadzonych jest w warunkach In vitro, możliwość wykorzystania mysich modeli w warunkach In vivo przy współpracy z Institute of BioMedicine, University of Turku, Finland, znacząco wspomaga nasze możliwości eksperymentalne.
Znaczącą część naszych badań stanowią eksperymenty nas poziomie przedklinicznym, dotyczące zastosowania szeregu związków w tzw. terapii celowanej nowotworów i wyjaśnieniu ich mechanizmu działania na poziomie molekularnym. W chwili obecnej prowadzimy badania nad przeciw -nowotworowym działaniem pochodnych kumaryn izolowanych z roślin leczniczych krajów Dalekiego Wschodu ( we współpracy z Katedrą i Zakładem Farmakognozji z Pracownią Roślin Leczniczych UM w Lublinie). Wstępne wyniki sugerują, że pochodne kumaryn mogą być rozważane jako potencjalne cytostatyki w przyszłości.
Szczególną uwagę przykładamy do badań nad inhibitorami deacetylaz histonów (HDI) jako potencjalnymi terapeutykami w chorobach nowotworowych i neurologicznych. HDI są obiecującą grupą  związków o działaniu przeciwnowotworowym. Dokładny mechanizm działania HDI pozostaje niewyjaśniony. HDI hamują aktywność specyficznych enzymów – deacetylaz histonów, co prowadzi do zmian w strukturze chromatyny i zmian w ekspresji specyficznych genów. Nasze badania wykazały efekt terapeutyczny zastosowania kwasu walproinowego (VPA) i SAHA w stosunku do komórek raka krtani in vitro. Oba HDI hamują proliferację, indukują apoptozę oraz spowalniają przebieg cyklu komórkowego. Wzmagają też wrażliwość komórek raka krtani na cisplatynę (CDDP).
Badania prowadzone w KBBM wykazały użyteczność różnego typu biomarkerów nowotworowych jako czynników prognostycznych chorób nowotworowych, ze szczególnym uwzględnieniem mutacji p53 i innych w nowotworach endometrium [5-9]. Obecnie staramy się wyjaśnić rolę czynnika transkrypcyjnego YB-1 (Y-box-binding protein 1) w raku jajnika. W naszych eksperymentach dokonaliśmy wyciszenia ekspresji YB-1 w liniach komórkowych raka jajnika (OV-90, TOV-112D, CAOV-3 oraz OVCAR-3) przy użyciu krótkołańcuchowych RNA (siRNA). Dokonaliśmy też analizy ekspresji genów zależnych od YB-1 przy pomocy techniki mikromacierzy i ilościowej PCR (real-time PCR). Co więcej, dokonaliśmy też analizy ekspresji YB-1 i zależnych od niego genów w nowotworach otrzymanych pooperacyjnie na poziomie RNA (real-time PCR), oraz białka (immunohistochemia, technika Western-bloting). Naszym celem jest identyfikacja nowych genów zależnych od YB-1, jak również korelacja ich ekspresji z progresją kliniczną raka jajnika. Mamy nadzieję, że pozwoli to na zastosowanie ich jako czynników prognostycznych oraz potencjalnych biomarkerów procesu nowotworowego i przyczyni się do rozwoju nowych strategii postepowania u pacjentek z rakiem jajnika.
Bardziej klinicznie uwarunkowane badania KBBM dotyczą roli biomarkerów u pacjentów z udarem mózgu oraz ich związek ze stanem klinicznym pacjentów po udarze. Wykazaliśmy, że obecność białka Tau w surowicy pacjentów podczas ostrej fazy udaru jest źle rokującym czynnikiem prognostycznym [10]. Co więcej, metaloproteinaza 9 (MMP9) przyczynia się do podniesienia stężenia białka Tau w surowicy krwi podczas ostrej fazy udaru [11]. Zaproponowaliśmy również nowy marker radiologicznego uszkodzenia mózgu w badaniu tomografii komputerowej (stosunek objętości do gęstości zmiany – VDR), który koreluje ze stężeniem białka S100B w surowicy oraz neurologicznym stanem klinicznym pacjentów podczas ostrego udaru mózgu [12].
Obecnie w KBBM zatrudnionych jest 8 osób ze stopniem naukowym doktora, 3 ze stopniem magistra, 2 osoby ze stopniem magistra w ramach studiów doktoranckich, 1 osoba na stanowisku pracownika naukowo-technicznego oraz 6 osób na stanowisku technika w pełnym wymiarze czasu pracy.
Kompletny wykaz publikacji naukowych pracowników Katedry są dostępne na stronie internetowej:
http://www.umlub.pl/dzialalnosc_id_5766.html

Powierzchnia pomieszczeń do badań naukowych Katedry i Zakładu Biochemii i Biologii Molekularnej wynosi ogółem 222,5 m2, na które składają się:

chłodnia (8,81 m2),
ciemnia fotograficzna (11,6 m2),
pracownia mikroskopu konfokalnego  (9,03 m2),
I pomieszczenie laboratoryjne (27,2 m2)
II l pomieszczenie laboratoryjne (56,1 m2) – laboratorium biologii molekularnej I hodowli komórkowych
III pomieszczenie laboratoryjne (54,9 m2) – pracownia cystometrii przepływowej,
IV pomieszczenie laboratoryjne (54,9 m2) – pracownia biochemiczna

KBBM posiada również 6 pomieszczeń (6 x 20,5 m2) wyposażonych w komputery, gdzie nie prowadzi się prac doświadczalnych, jak również  dodatkowe pomieszczenia do prowadzenia zajęć praktycznych dla studentów oraz 2 pomieszczenia dla personelu technicznego.
 
Obecnie KBBM jest wyposażona w: 

  1. Mikroskop konfokalny laserowy: A1 Nikon Eclipse Ti, wyposażony  w live-box system do prowadzenia obserwacji żywych komórek oraz aplikacje FRET i TIRF.
  2.  Aparat do reakcji PCR w czasie rzeczywistym Real-time PCR: Roche Lightcycler 480 II
  3.  Automatyczna stacja pipetująca: Eppendorf epMotion 5070
  4.  Termocyklery gradientowe: Biometra T Professional Thermocycler
  5.  Cytometr przepływowy: BD Facscalibur
  6.  Odwrócony mikroskop fluorescencyjny z kamerą do hodowli komórkowych: Nikon Eclipse TS100
  7.  Kompletnie wyposażoną pracownię hodowli komórkowych
  8.  Wirówki i ultrawirówka (MSE)
  9.  Systemy do poziomej i pionowej elektroforezy, aparaty do Western-bloting (Bio-Rad)
  10.  Czytnik ELISA (fluorescencja, chemiluminescencja)
  11.  Zamrażarka niskich temperatur  -80 oC  


KBBM otrzyma wkrótce (10-12/2011 – 1-6.2012) aparaturę naukową wyszczególnioną poniżej. (Narodowa Strategia Spójności - Działanie I.3. Wspieranie Innowacji):

  1.  Kompletne wyposażenie drugiej pracowni hodowli komórkowych
  2.  System wizualizacji żeli I chemiluminescencji (2-D Molecular Imaging System)
  3.  System mrożenia próbek w ciekłym azocie
  4.  Dwie zamrażarki niskich temperatur  -80 o
  5.  Magnetyczny sorter komórek
  6.  Wirówki laboratoryjne
  7.  Systemy do poziomej I pionowej elektroforezy, aparaty do Western-bloting
  8.  Termomiksery
  9.  Wytrząsarki, platformy I miksery laboratoryjne,
  10.  Systemy sonikacji I homogenizacji próbek


Posiadamy również dostęp do aparatury naukowej w innych jednostkach UM.

Publikacje cytowane w tekście:

  1. Stepulak A, Sifringer M, Rzeski W i wsp. AMPA antagonists inhibit the extracellular signal regulated kinase pathway and suppress lung cancer growth. Cancer Biol Ther 2007; 6: 1908-15.
  2. Stepulak A, Sifringer M, Rzeski W i wsp. NMDA antagonist inhibits the extracellular signal-regulated kinase pathway and suppresses cancer growth. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102: 15605-10.
  3. Stepulak A, Luksch H, Gebhardt C i wsp. Expression of glutamate receptor subunits in human cancers. Histochem Cell Biol 2009; 132: 435-45.
  4. Brocke KS, Staufner C, Luksch H i wsp. Glutamate receptors in pediatric tumors of the central nervous system. Cancer Biol Ther; 2010; 9: 455-68.
  5. Futyma K, Putowski L, Cybulski M, Miotla P, Rechberger T, Semczuk A. The prevalence of mtDNA4977 deletion in primary human endometrial carcinomas and matched control samples. Oncol Rep 2008; 20: 683-8.
  6. Jeczen R, Skomra D, Cybulski M i wsp. P53/MDM2 overexpression in metastatic endometrial cancer: correlation with clinicopathological features and patient outcome. Clin Exp Metastasis 2007; 24: 503-11.
  7. Olcha P, Cybulski M, Skomra D i wsp. The pattern of p14ARF expression in primary and metastatic human endometrial carcinomas: correlation with clinicopathological features and TP53 pathway alterations. Int J Gynecol Cancer; 2010; 20: 993-9.
  8. Semczuk A, Marzec B, Skomra D, Roessner A, Cybulski M, Rechberger T, Schneider-Stock R. Allelic loss at TP53 is not related to p53 protein overexpression in primary human endometrial carcinomas. Oncology 2005; 69: 317-25.
  9. Szewczuk W, Skomra D, Cybulski M i wsp. Allelic loss at TP53 in metastatic human endometrial carcinomas. Clin Exp Metastasis 2009; 26: 789-96.
  10. Bielewicz J, Kurzepa J, Czekajska-Chehab E, Stelmasiak Z, Bartosik-Psujek H. Does Serum Tau Protein Predict the Outcome of Patients with Ischemic Stroke? J Mol Neurosci.2010, in press
  11. Kurzepa J, Bielewicz J, Grabarska A, Stelmasiak Z, Stryjecka-Zimmer M, Bartosik-Psujek H. Matrix metalloproteinase-9 contributes to the increase of tau protein in serum during acute ischemic stroke. J Clin Neurosci; 2010; 17: 997-9.
  12.  Kurzepa J, Bielewicz J, Czekajska-Chehab E, Kurzepa J, Bartosik-Psujek H, Grabarska A, Stelmasiak Z. CT volume/density ratio as the marker of ischaemic brain injury. Acta Neurol Scand.  2011; 5: 310-315

Projekty realizowane ze środków zewnętrznych (KBN/NCN)

Tytuł projektu:
N407 092 32/3452 - „Ocena ekspresji genu YB-1 i identyfikacja genów YB-1 zależnych w prawidłowych i nowotworowych liniach komórkowych oraz fizjologicznej i patologicznej tkance jajnika.”

Dane osoby do kontaktu
1. Dr n.med. Marek Cybulski, marekc@bg.umlub.pl
2. Mgr Witold Jeleniewicz, witekjel@wp.pl

Streszczenie projektu
YB-1 jest multipotencjalnym białkiem zaangażowanym  w szereg procesów komórkowych, takich jak transkrypcja, translacja, naprawa DNA czy apoptoza. Szczególnie istotne z punktu widzenia onkologii wydaje się funkcjonowanie tego białka jako czynnika transkrypcyjnego. W przypadku wielu typów nowotworów został zaobserwowany zwiększony poziom komórkowej ekspresji YB-1 oraz dodatkowo nasilona translokacja białka do jądra komórkowego, gdzie bierze ono udział w regulacji ekspresji szerokiego spektrum genów, między innymi genów odpowiedzialnych za proliferację oraz oporność na chemioterapeutyki. W naszych badaniach staramy się poznać wpływ YB-1 na ekspresję genów zaangażowanych zwłaszcza w patogenezę raka jajnika.
Analiza ekspresji genów prowadzona jest z zastosowaniem technik mikromacierzy oraz ilościowego Real-time RT-PCR. Całkowite RNA izolowane jest z materiału klinicznego stanowiącego wycinki guzów oraz z linii komórek nowotworowych hodowanych in vitro, a następnie odwrotnie transkrybowane z użyciem primerów oligo(dT). W badaniach profilu ekspresji używane są znakowane fluorescencyjnie macierze DNA zawierające 24 923 oligonukleotydowych sond komplementarnych do ludzkich cDNA (Human Whole Genome DNA Microarray, Eurogenetec). Dokładniejsza ilościowa technika Real-time RT-PCR wykonywana jest z użyciem sond hydrolizujących znakowanych fluorescencyjnie (UPL, Roche Applied Science) stosowanych w dupleksach dla genu badanego oraz genu referencyjnego GAPD. Analiza otrzymanych wyników przeprowadzana jest z uwzględnieniem efektywności reakcji amplifikacji.

Tytuł projektu:

N N401 098839 Inhibitory deacetylaz histonów jako potencjalne cytostatyki w komórkach raka krtani. Badania in vitro

Dane osoby do kontaktu

1. mgr Aneta Grabarska, anetagrabarska@vp.pl
2. Dr hab. n. med. Andrzej Stepulak,  andrzej.stepulak@umlub.pl

Streszczenie projektu

Rak krtani jest powszechnym na świecie nowotworem regionu głowy i szyi u mężczyzn. Molekularne mechanizmy indukujące transformację i progresję raka krtani nie zostały w pełni poznane. Rutynową metodą leczenia raka krtani jest chirurgia i radioterapia. Chemioterapia z wykorzystaniem cisplatyny (CDDP) oraz fluorouracylu (5-FU) jest stosowana w przypadku niepowodzeń standardowego leczenia lub znacznego stopnia zaawansowania nowotworu. Istotne staje się więc poszukiwanie nowej generacji chemioterapeutyków, które byłyby skuteczne w terapii raka krtani, Obiecującą grupę związków o charakterze cytostatyków nowej generacji stanowią inhibitory deacetylaz histonów (HDI). Terapeutyczny potencjał HDIs, pomimo ich różnic strukturalnych, wynika z ich szerokiej aktywności anty-nowotworowej połączonej z niską toksycznością względem komórek prawidłowych. Istotnym elementem przeciwnowotworowego działania HDI jest ich synergistyczne działanie z innymi chemioterapeutykami (CDDP, 5-FU), co pozwala zmniejszyć dawki cytostatyków, aby uzyskać zbliżony lub lepszy efekt terapeutyczny. Biologiczne skutki działania tych substancji są różne. Zaobserwowano hamowanie przebiegu cyklu komórkowego, indukcję apoptozy lub różnicowanie się komórek. Materiał do badań stanowią linie komórkowe RK33 oraz RK45. Linie te wyprowadzono
z komórek płaskonabłonkowego raka krtani, pobranych od pacjentów po przeprowadzonym zabiegu laryngektomiicałkowitej.
Badania obejmują:
1) Ocenę proliferacji i apoptozy komórek linii raka krtani RK33, RK45, poddanych działaniu inhibitorów deacetylaz histonów: SAHA i VPA (kwas walproinowy) oraz CDDP.
2) Badanie mechanizmów działania HDI na poziomie molekularnym:
określenie stopnia acetylacji poszczególnych reszt lizyny histonów H3 i H4; ocenę aktywności oraz ekspresji HDACs na poziomie białka i mRNA; próbę identyfikacji deacetylazy/deacetylaz histonów, których hamowanie jest odpowiedzialne za przeciwnowotworowy efekt działania VPA i SAHA w komórkach raka krtani linii RK33, RK45 (knock-out genów HDAC, siRNA).
Głównym efektem projektu będzie stwierdzenie, czy HDI znacząco wpływają na hamowanie proliferacji komórek raka krtani w badaniach In vitro, a przez to potencjalnie mogą być w przyszłości zastosowane w leczeniu raka krtani u pacjentów, zarówno w monoterapii, jak i w połączeniu z dotychczas stosowanymi chemioterapeutykami. Biorąc pod uwagę, że CDDP wywołuje dość liczne działania uboczne u leczonych pacjentów, obniżenie dawki tego cytostatyku po dodatkowym zastosowaniu HDI, przy jednoczesnym utrzymaniu efektu terapeutycznego wydaje się być interesującą alternatywą terapeutyczną. Na uwagę zasługuje fakt, że jeden z badanych HDI – kwas walproinowy – jest lekiem zaaprobowanym do leczenia pacjentów z niektórymi postaciami padaczki. Dlatego też mógłby być stosunkowo szybko wprowadzony do prób klinicznych leczenia pacjentów z rakiem krtani.

Oferta współpracy
Co Państwo mogą zaoferować przedsiębiorcom , jakiego typu badania, jakim sprzętem Państwo dysponują

1. Badania substancji o potencjalnym charakterze  leczniczym na poziomie przedklinicznym
 1) testy oceny proliferacji, migracji, analizy stopnia apoptozy oraz przebiegu cyklu komórkowego
 2) badanie ekspresji specyficznych genów w liniach komórkowych lub materiale pochodzenia klinicznego
 3) analiza mechanizmu działania konkretnych substancji na poziomie molekularnym

2. badania przydatności potencjalnych biomarkerów w diagnostyce
 1) analiza ekspresji genów w materiale klinicznym (krew,, tkanki)
 2) analiza ekspresji białek (płyny ustrojowe, tkanki)

Ostatnia modyfikacja: czwartek, 5 grudnia 2013, 09:07
Rozwój Polski Wschodniej
Przebudowa Centrum Innowacyjnych Technologii Nanobiomedycznych Uniwersytetu Medycznego w Lublinie
Projekt finansowany ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego
w ramach Programu Operacyjnego Rozwój Polski Wschodniej